Sequenciamento e hibridização de ácidos nucleicos

  Olá pessoal, hoje eu trago mais alguns apontamentos em biologia molecular, dessa vez sobre sequenciamento e hibridização de ácidos nucleicos:

* Sequenciamento de 1ª Geração

- Degradação química – Maxam & Gilbert

- Interrupção da cadeia (ddNTPs) – Sanger

* Sequenciamento de 2ª Geração

- 454 – Roche

- Illumina – HiSeq, MiSeq

* Sequenciamento de 3ª Geração

- Ion Torrent – ABI -‐Life Technologies

- Nanopore – GridIon / MiniIon

- PacBio RS – Pacific Biosciences

 Agora serão detalhados os principais métodos dos supracitados:

 As tecnologias de primeira geração, também conhecidas como sequenciamento clássico, foram as pioneiras na área. O sequenciamento de Sanger, o mais famoso e mais utilizado por cerca de 30 anos e o de Maxam-Gilbert são as tecnologias que compõem essa primeira geração.

Sequenciamento por método químico (Maxam-Gilbert)

 Sequenciamento por destruição de bases. Nesse método é necessário:

• DNA alvo e nucleases (nucleases são enzimas DNases e RNases);
• Extremidade 5' do DNA marcada radioativamente com ³²P;
• Material dividido em 4 amostras (DNA alvo é clivado em 4 regiões (antes do “G”, “G/A”, “C/T” e “C”s);
• Reagente destrói bases nitrogenadas;
• Geração de fragmentos diferentes em cada tubo;
• Separação dos fragmentos em gel de poliacrilamida desnaturante: cada banda tem uma diferença de nucleotídeo;
• Análise do padrão de bandas.

 Metodologia de sequenciamento proposta por Maxam-Gilbert

1.  Em (A) adiciona-se um fosfato radioativo numa das extremidades após a separação da dupla fita do DNA;
2.  Em seguida, o DNA marcado é colocado em quatro tubos, onde ocorre a clivagem dele, através da utilização de compostos químicos, em posições específicas (antes dos “G”s, antes de G ou A, antes de C ou T e antes dos “C”s);
3. Para identificar a sequência de nucleotídeos do DNA, aplica-se o produto das quatro reações em canaletas diferentes do gel. Após a separação, o perfil de bandas obtidas deve ser lido de baixo para cima, uma a uma representando os nucleotídeos;
4. Observe que quando uma banda aparece em G/A e ao mesmo tempo só em G, significa que o nucleotídeo da respectiva posição é o G. Caso a banda seja observada apenas em G/A, então o nucleotídeo da respectiva posição é o A. A mesma lógica segue para C/T e T;
5. (B) Representação esquemática evidenciando o último nucleotídeo de cada um dos fragmentos do gel;
6. (C) Sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado.

 Por que o fósforo radioativo?

 Porque as bandas geradas após a “corrida” destes fragmentos em gel de poliacrilamida podem ser visualizadas após a impressão de uma chapa radiográfica.

Sequenciamento por método enzimático (Sanger)

 Decifra o código de uma fita de DNA através de sua síntese in vitro. Utiliza finalizadores de cadeia 2',3'-didesoxirribonucleotídeos trifosfatados (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP). ddNTPs são necessários para o alongamento da cadeia, mas os dNTPs bloqueiam a extensão da cadeia.

 No método enzimático, a reação deve conter:

• DNA molde para a cadeia a ser sintetizada;
• Oligonucleotídeo iniciador: primer;
• Nucleotídeos A, T, C e G;
• Enzima polimerase;
• Didesoxirribonucleotídeos trifosfatados (ddNTPs).

 Ao final se faz uma eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante.

Sequenciamento pelo método de Sanger. 

1.  Com base no processo de sequenciamento proposto por Maxam-Gilbert, Sanger reduziu os trabalhos e facilitou o processo, tornando a dinâmica de sequenciamento mais rápida. Para isso incorporou os reagentes padrões para uma técnica de PCR, com a adição em tubos isolados dos respectivos didesoxinucleotídeos (ddNTP);
2.  Cada vez que um ciclo de PCR era finalizado um fragmento de DNA de tamanho distinto poderia ser formado, e esta variação dependia da incorporação de um ddNTP ou desoxinucleotídeo (dNTP). Se acaso o ddNTP fosse incorporado, por falta da hidroxila na posição 3 da pentose, o processo de extensão da cadeia crescente era interrompido (comparar estruturas);
3.  Após inúmeros ciclos de PCR, amostras dos respectivos tubos, contendo especificamente seus respectivos ddNTPs são aplicadas em canaletas individualizadas do gel de acrilamida;
4.  Feita a eletroforese, o perfil de bandas, lidas de baixo pra cima, determina a correta sequência da molécula de DNA em sua fita complementar, logo o reverso complementar poderia ser definido.

 Assim como a metodologia de Maxam-Gilbert, a técnica desenvolvida por Sanger também utiliza marcação radioativa. A diferença é que a primeira marcava diretamente o DNA molde. Já a de Sanger marca fragmentos de DNA sintetizados a partir de uma fita molde. A síntese desses fragmentos a partir de um DNA molde foi possível graças a PCR.

Fluoróforos no lugar de compostos radioativos

 A partir do aprimoramento do sequenciamento de Sanger surgiu o método de sequenciamento enzimático semiautomático. A principal modificação foi, no lugar de compostos radioativos,

adicionar aos didesoxinucleotídeos corantes capazes de emitir fluorescência quando excitados em comprimento de onda específico. Como os dideóxi passaram a ser marcados com fluoróforos , agora as 4 reações passaram a poder ocorrer no mesmo tubo, aumentando 4x a velocidade do ensaio.

 No método de sequenciamento enzimático automatizado os géis de difícil manuseio foram

substituídos por finíssimos capilares preenchidos com gel onde os fragmentos de DNA são separados em altíssima velocidade. Após a eletroinjeção os fragmentos começam a migrar até passarem por

um feixe de laser que excita os fluoróforos em cada dNTP fazendo com que esses emitam uma fluorescência característica de cada nucleotídeo. Um detector registra esta fluorescência e a transmite para um computador que possui um software capaz de converter fluorescência em picos coloridos, reconhecendo os 4 nucleotídeos.

 Assim, método enzimático pode ser manual, semiautomático ou automático, porém o princípio é o mesmo. No método enzimático automático o procedimento tem alguns detalhes a mais:

• ddNTPs são marcados com grupo fluorescente;
• A síntese é realizada dentro de um único tubo: mesma canaleta do gel;
• Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante;
• Análise das bandas: um laser no final do gel excita os diferentes grupos fluorescentes , cada um produz um pico de emissão diferente captado por um detector;
• Sequenciadores automáticos detectam a fluorescência e o resultado é um cromatograma com 4 cores mostrando picos que representam cada uma das 4 bases do DNA.

Automatização do método de Sanger

1.  Após a desnaturação da dupla fita, didesoxinucleotídeos marcados com compostos florescentes são incorporados à cadeia nascente de DNA sintetizada pela DNA polimerase;
2.  Através de um sistema de eletroinjeção, os fragmentos de DNA recém-sintetizados começam a migrar e encontram, num determinado ponto, um feixe de raios laser que excita os fluoróforos fazendo com que estes emitam fluorescência característica de um dos quatro tipos de nucleotídeos;
3.  Um detector registra a intensidade e comprimento de onda desta fluorescência e a transmite a um computador que possui um software capaz de converter fluorescência em picos coloridos (cromatograma) que são decodificados na sequencia de nucleotídeos do fragmento.

Hibridização de ácidos nucleicos

 Ensaios de hibridização de ácidos nucleicos envolvem princípios de hibridização de ácidos nucleicos, preparação de sondas de ácidos nucleicos. São ensaios de hibridização de ácidos nucleicos:

• Southern, Northern e Western blotting;
• Fingerprints de DNA;
• Hibridização in situ de tecidos;
• Chips de DNA/microarranjos/microarrays;
• Entre outros.

Princípios de hibridização de ácidos nucleicos

 A hibridização de ácidos nucleicos é um método que utiliza a tendência natural que uma cadeia simples de DNA tem de se reassociar com sua cadeia complementar para formar a dupla hélice.

 Sendo assim, uma sonda é um segmento definido de ácido nucleico que pode ser usado para identificar moléculas específicas de DNA portadoras da sequência complementar. É importante saber que duas sequências complementares formam uma molécula híbrida, a molécula com sequência conhecida é chamada de sonda porque ela detecta a sequência desconhecida.

 Geralmente a temperatura de hibridização com a sonda é cerca de 60°C (quanto mais alta a temperatura, mais estringente). Uma sonda é um DNA da sequência que deseja se estudar marcado com moléculas que imitem algum tipo de sinal - tipos de sonda: radioativa, quimioluminescente, fluorescente etc.

*Observação: estringência é definida como um conjunto de condições que interfere na associação das fitas de ácidos nucleicos. É o grau com que as condições de hibridização toleram o mau pareamento de bases nos heterodúplices (ácido nucleico dupla fita formado a partir de 2 ácidos nucleicos fita simples que não se originaram do mesmo alelo). Em condições de alta estringência de hibridização, apenas as sequências perfeitamente pareadas podem anelar, mas heterodúplices com maus pareamentos significativos podem se tornar estáveis se a estringência for diminuída pela redução da temperatura de anelamento ou pelo aumento da concentração de sal.

 A sonda de DNA é marcada de tal forma que permita ser detectada a sua presença, a marcação é feita incorporando-se a ela: 

• Átomos radioativos; 
• Corantes fluorescentes; 
• Corantes cromogênicos (substâncias incolores que produzem cor ao interagirem com um determinado meio).

 Em alguns casos, a sonda pode ser feita de RNA em vez de DNA, sondas de RNA são chamas de ribossondas.

 

 Essa sonda irá parear com qualquer sequência de DNA complementar a ela. Portanto, se a sequência procurada não estiver presente na amostra não haverá o pareamento. A presença ou não da sonda na membrana onde ocorreu a hibridização (e as posições onde ela está presente) é revelada por uma autorradiografia em um filme de raio X ou pelo aparecimento de uma cor caso a marcação cromogênica tenha sido usada.

*Observação: oligonucleotídeo = sonda = probe

Hibridização DNA-DNA:

Hibridização de ácidos nucleicos: 

• (A) Se a hélice de DNA for separada em duas fitas, as fitas deverão se reanelar, dadas as condições iônicas e o tempo apropriados (hibridização DNA-DNA); 
• (B) Da mesma forma, se o DNA for separado em suas duas fitas, o RNA deverá ser capaz de se ligar aos genes que o codificam (hibridização RNA-DNA). Se estiver presente em quantidades suficientemente grandes em comparação com o DNA, o RNA substituirá uma das cadeias de DNA nesta região.

Método de preparação de DNA complementar (cDNA): como o RNA é muito instável, o estudo dos transcritos geralmente é feito utilizando-se de um cDNA produzido a partir do RNAm de interesse.

• A maior parte do mRNA contém uma longa extensão de resíduos de adenosina (AAAn) na extremidade 3’ da mensagem; portanto, os investigadores reanelam um primer que consiste em 15 resíduos de desoxitimidina (dT15) na extremidade 3 'da mensagem; 
• A transcriptase reversa transcreve então uma fita de DNA complementar, começando no iniciador dT15;
• O cDNA pode ser isolado aumentando o pH da solução, desnaturando assim o híbrido de cadeia dupla e clivando o RNA.

Ensaios padrão de hibridização de ácidos nucleicos:

• Southern blot - DNA;
• Northern blot - RNA;
• Western blot - proteína.

 O método Southern blot foi batizado com o nome de seu inventor, o biólogo britânico Edwin Mellor Southern (1938-vivo), e isso fez com que outros métodos de blot fossem batizados com trocadilhos ao nome de Southern (''southern'' significa ''do sul'' em inglês), por exemplo, Western blot e Northern blot.

 Southern blotting:

 Em 1975, Edwin Southern da Universidade de Oxford descreveu a técnica de Southern blotting, utilizada para detectar sequências de DNA no genoma através da complementaridade com a sonda. Essa técnica permite a identificação de DNA a partir das propriedades do paramento complementar.

 Uma amostra de DNA purificado é digerida com uma ou mais endonucleases de restrição, gerando fragmentos de restrição que possuem de várias centenas até milhares de pares de bases. Esses fragmentos de restrição são separados de acordo com seu tamanho por eletroforese em gel de agarose, desnaturados e transferidos para uma mebrana de nitrocleulose ou náilon. Sondas marcadas são hibridizadas ao DNA-alvo imobilizado na membrana, e a posição das heterodúplices marcadas é revelada por autorradiografia.

 Uma aplicação importante da hibridização de Southern blot é a identificação de sequências-alvo semelhantes, mas não idênticas, ao gene utilizado como sonda. As sequências-alvo podem ser membros de uma família de genes evolutivamente relacionados, ou sequências de DNA de um mesmo genoma, ou ainda um equivalente direto da sonda derivado de um genoma diferente. No último caso, os genomas utilizados como amostra podem ser derivados de indivíduos diferentes de uma mesma espécie, ou podem representar espécies diferentes (constituindo um zoo blot). Quando uma nova sonda isolada apresentar relação com outra sequências ainda não caracterizadas, pode-se tentar isolar os outros membros desta família por meio da triagem de bibliotecas de DNA apropriadas.

 Princípios da técnica de Southern blotting:

1. Digestão do DNA genômico com enzima de restrição (qual enzima usar? depende do objetivo do projeto);
2. Separação dos fragmentos em gel de agarose ou poliacrilamida, visualização com luz UV (rastro);
3. Desnaturação dos fragmentos (imersão do gel em solução de NaOH) e transferência do DNA fita simples para membrana de nylon ou nitrocelulose;
4. Hibridização do DNA com a sonda na temperatura de 60°C (quanto mais alta a temperatura, mais estringente);
5. Lavagem para retirada do excesso de sonda (quanto maior a temperatura e concentração de dodecil sulfato de sódio (SDS), mais estringente);
6. Exposição ao filme autorradiográfico;
7. Revelação do filme em decorrência da radioatividade ou fluorescência da sonda excitar as partículas do filme. Onde o filme foi excitado ocorre a precipitação de partículas de prata, o que gera uma marcação.

Pontos-chave do Southern blotting:

1. DNA fragmentado com enzimas de restrição;
2. Separação em gel de agarose;
3. Desnaturação dos fragmentos em solução salina;
4. Transferência para a membrana;
5. Imersão da membrana em solução com sonda marcada;
6. Lavagem;
7. Membrana exposta a um filme de raio X.

Procedimento para o Southern blotting:

A: O DNA é clivado com enzimas de restrição e separado por eletroforese.

B: Os fragmentos de DNA são transferidos para um filtro de nitrocelulose.

C: O filtro é exposto a uma solução que contém uma sonda radiomarcada, permitindo a hibridização com sequências de DNA alvo.

D: As bandas no filtro são então expostas ao filme de raios X para visualização.

Hibridização de Southern blot:

1. Uma amostra de DNA complexa é digerida com endonucleases de restrição;
2. Os fragmentos resultantes são aplicados em um gel de agarose e separados por tamanho utilizando eletroforese;
3. O gel é tratado com uma substância alcalina - a fim de desnaturar o DNA, para então ser incubado com uma membrana de nitrocelulose ou náilon;
4. O DNA será transferido do gel para a membrana, a qual será submetida a uma solução contendo uma sonda de DNA de fita simples, marcada radioativamente;
5. Após a hibridização, a membrana é lavada para remover o excesso de sonda e, então, é submetida à secagem;
6. A membrana é colocada em contato com um filme de raio X, e a posição da sonda marcada causará uma imagem latente no filme, que poderá ser revelada por autorradiografia como uma banda de hibridização.

Portanto, o Southern blotting terá:

1. Digestão do DNA com enzimas de restrição;
2. Eletroforese;
3. Transferência por capilaridade do DNA para a membrana;
4. Hibridização com uma sonda de DNA marcada com radioatividade ou quimioluminescência.

 Aplicações do Southern blotting:

• Identificar alterações em um único nucleotídeo;
• Detecção de inserções, deleções e rearranjos;
• Ordenamento de fragmentos do DNA em um mapa físico;
• Fragmentos cromossômicos.

Southern blots de DNA de vários organismos usando uma sonda radioativa do gene Antennapedia de Drosophila melanogaster. 

1. Como não esperamos que as sequências entre essas espécies divergentes sejam perfeitamente idênticas, o rigor da hibridização é reduzido pela alteração das condições salinas (essas manchas de baixa estringência nos filos são coloquialmente chamadas de "zoo blot").
2. Um zoo blot ou garden blot é um tipo de Southern blot que demonstra a semelhança entre sequências de DNA específicas, geralmente codificadoras de proteínas, de diferentes espécies. 
3. A autorradiografia mostra que os genes da Drosophila contêm várias porções que são semelhantes aos genes da Antennapedia em estrutura e que muitos organismos contêm vários genes que irão hibridizar esse fragmento do gene radioativo, sugerindo que genes semelhantes a Antennapedia existem nesses organismos. 
4. Os números ao lado das manchas indicam o tamanho das bandas, em quilobases. (Extraído de McGinnis et al., 1984, cortesia de W. McGinnis.)

 Variações do Southern blotting:

• Transferência Northern - RNA é transferido;
• Transferência Western - proteína é transferida.

Northern blotting:

 Transferência de molécula de RNA de gel de agarose para membrana de náilon ou nitrocelulose.

• Moléculas de RNA são muito sensíveis;
• Estrutura secundária: manter desnaturação durante eletroforese;
• Hibridizadas com sondas de DNA ou RNA;
• Método muito útil para estudos de expressão gênica.

Pontos-chave do Northern blotting:

1. RNA não digerido;
2. Separação em gel de agarose;
3. Transferência de material do gel para uma membrana de nylon ou nitrocelulose por capilaridade;
4. Imersão da membrana em solução com sonda marcada: duas sequências complementares formam uma molécula híbrida, a molécula com sequência conhecida é chamada de sonda porque ela detecta a sequência desconhecida;
5. Lavagem;
6. Membrana exposta a um filme de raio X.

  Na hibridização de Northern blot, a amostra contém moléculas de RNA não digeridas, em vez de DNA. É um método de transferência, com a transferência capilar de RNA de um gel de eletroforese para uma membrana. Usa sondas oligonucleotídicas marcadas que são complementares à sequência de RNA alvo. A incubação permite a hibridização da sonda com o RNA alvo.

 Essa metodologia é usada principalmente com o objetivo de obter informações a respeito do padrão de expressão de genes específicos. Quando um gene é clonado, ele pode ser utilizado como sonda e hibridizado em um Northern blot contendo amostras de RNA isolados de diversos tecidos. Os dados obtidos podem fornecer informações sobre as linhagens celulares nas quais o gene é expresso, bem como sobre a abundância relativa de seus transcritos, medida pela intensidade relativa da banda de hibridização. Além disso, quando há identificação de transcritos de diferentes tamanhos, este ensaio pode fornecer evidências para a existência de diferentes isoformas, como aquelas que resultam de promotores alternativos e ainda de sítios alternativos de splicing ou de poliadenilação (cauda poli-A).

Northern blotting no desenvolvimento:

(A – E) Procedimento para Northern blotting. 

(A) O RNA é isolado de vários tecidos e é separado por tamanho usando eletroforese em gel. 

(B) O gel é então colocado sobre um pavio de papel, que absorve uma solução iônica de uma calha. 

(C) Um filtro que retém o RNA é colocado acima do gel e papel absorvente é colocado acima do filtro. A ação capilar atrai a solução através do gel, prendendo o RNA no filtro. 

(D) O filtro é incubado com DNA de fita simples radioativo complementar ao mRNA de interesse. 

(E) Após a lavagem de qualquer DNA não ligado, a autorradiografia localiza o mRNA nas amostras que o contêm. 

(F) Desenho de um Northern blot de desenvolvimento mostrando a presença de mRNA de Pax6 no olho, cérebro e pâncreas de um embrião de mamífero. (após F Ton et al. 1991.)

Western blotting:

• Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida;
• Separação e caracterização de proteínas;
• Uso de SDS (dodecil sulfato de sódio) para desnaturação;
• Transferência para a membrana por força elétrica;
• Proteína alvo é identificado por meio de anticorpo mono ou policlonal;
• Revelação do sistema com anticorpo secundário fluorescente, radioativo ou colorimétrico;
• Informa o tamanho e a quantidade das proteínas.

 O princípio básico é a eletroforese das proteínas em gel de poliacrilamida, seguida pela transferência elétrica para a membrana com uma posterior detecção das proteínas por meio de anticorpos.

Pontos-chave do Western blot:

1. As proteínas da amostra são aplicadas a um gel de eletroforese (em certas situações, as proteínas devem ser desnaturadas antes de serem aplicadas);
2. Método de blotting: as proteínas são transferidas eletroforeticamente (usando um campo elétrico) do gel para a membrana de blotting;
3. Uso de anticorpos específicos para a proteína alvo; este anticorpo pode ser: não marcado ou primário (mais comum) → em caso afirmativo, é usado um anticorpo secundário marcado que pode ligar-se ao anticorpo primário; marcado (menos comum);
4. A incubação permite a formação de complexos anticorpo-antígeno.
   

Procedimento para o Western blotting:

A: As amostras de proteínas são carregadas num gel e separadas por eletroforese.

B: As proteínas separadas são transferidas eletroforeticamente para uma membrana.

C: A membrana é incubada com um anticorpo primário específico para a proteína alvo, que permite a formação de complexos anticorpo-antígeno.

D: A membrana é incubada novamente com anticorpos secundários marcados, que se ligam aos anticorpos primários.

E: Neste caso, é adicionado um substrato que interage com os marcadores, permitindo a deteção por quimioluminescência.

SDS-PAGE, pela sigla em inglês: eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida

DNA fingerprinting:

  A primeira patente cobrindo o uso direto da variação do DNA para ciência forense foi registrada pelo estadunidense Jeffrey Glassberg (1947-vivo) em 1983, com base no trabalho que ele realizou enquanto estava na Universidade Rockefeller, nos Estados Unidos, em 1981.

O geneticista britânico Sir Alec Jeffreys (1950-vivo) desenvolveu de forma independente um processo para criação de perfis de DNA em 1985, enquanto trabalhava no Departamento de Genética da Universidade de Leicester.

 A técnica de DNA fingerpriting (em tradução livre para o português, impressão digital do DNA), a partir da análise do DNA de um organismo este pode ser identificado ao nível do individuo. Esta técnica é muito utilizada na investigação criminal para identificar criminosos a partir de resíduos de DNA (pele, sangue, esperma, cabelos, etc.) ou em testes de paternidade para identificar os pais (mãe e pai).

 Essa técnica é baseada nos padrões de bandas específicas nas transferências Southern do DNA genômico. Os princípios dos fingerprints de DNA são:

• Não existem dois indivíduos que tenham genomas com a mesma sequência de nucleotídeos;
• Genoma humano contém muitos polimorfismos de DNA.

 Para essa técnica é necessário obter informações confiáveis da frequência dos polimorfismos na população e ter cuidado na escolha das sondas. 

 Alec Jeffreys desenvolveu esta técnica na qual usou DNAs satélites também chamados de VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) como sonda, porque mostrava o alto nível de polimorfismo. A hibridização somada aos padrões da técnica RFLP (polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA) é útil na detecção de variações estruturais do DNA.

Etapas envolvidas na impressão digital de DNA:

1. Isolar o DNA;
2. Digerir o DNA com a ajuda de enzimas endonucleases de restrição;
3. Separar os fragmentos digeridos de acordo com o tamanho do fragmento pelo processo de eletroforese;
4. Transferência Southern dos fragmentos separados em membranas sintéticas como náilon;
5. Hibridizar os fragmentos utilizando sondas VNTR marcadas;
6. Analisando os fragmentos híbridos usando autorradiografia.

 Uma fração de DNA repetido consiste de regiões denominadas minissatélites ou repetição em tandem de número variável (VNTR – “variable number of tandem repeats”). Os VNTRs exibem uma enorme variabilidade e são constituídos de 9 a 100 pares de bases repetidos sequencialmente em loci cromossômicos.

 

 As primeiras seqüências VNTR descritas tiveram aplicação imediata na área forense, assim como no auxílio ao mapeamento do genoma humano. O termo “DNA fingerprint”, ou perfil de DNA, foi inicialmente concebido por Alec Jeffreys em 1985. O termo demonstra a alta variabilidade destas regiões do genoma, de maneira que seja improvável a existência de dois indivíduos com o mesmo perfil genético, a não ser no caso de gêmeos univitelinos.

 Os marcadores VNTR são analisados através da técnica RFLP (“restriction fragment lenght polymorphism”), a qual é baseada em mutações que alteram sequências no DNA de um indivíduo, de modo que enzimas de restrição podem perder a capacidade de clivar aquele DNA em posições ainda susceptíveis à clivagem nos DNAs de outros indivíduos.

 Assim, indivíduos podem ser diferenciados pelo comprimento de sequências VNTR do DNA gerados após a ação de uma enzima de restrição. O padrão de fragmentos é característico e herdado por indivíduos geneticamente relacionados, uma vez que a localização dos sítios de restrição é típica. Desta forma, por locus, cada sonda hibridiza com dois segmentos de DNA, correspondentes aos alelos materno e paterno de cada indivíduo. 

Metodologia de DNA fingerpriting:

1. A metodologia consiste em extração de DNA genômico e digestão com enzima de restrição. As mais utilizadas são Hae III, Pst I e Hinf I;
2. Em seguida, os produtos da digestão são separados em gel de agarose, desnaturados e transferidos para membrana própria para hibridização, técnica esta denominada Southern blot;
3. Uma sonda quimioluminescente, ou marcada radioativamente, complementar às sequências VNTR é, então, utilizada para, através de hibridização, detectar as sequências alvo. 
4. Os alelos VNTR, identificados pelas sondas, são visualizados após sensibilização de filmes de raios-X. A mesma membrana, com o DNA fixado, pode ser utilizada para hibridizações sequenciais com diferentes sondas, específicas para sequências VNTR em diferentes cromossomos 

 Inicialmente é feita a coleta da amostra, seguida de extração e clivagem do DNA. Depois da clivagem o material é separado por eletroforese seguida de marcação radioativa, finalizando com a comparação de fragmentos e obtenção da “impressão digital”:

Hibridização in situ de ácidos nucleicos:

 Uma reação de hibridização na qual uma sonda marcada é hibridizada a ácidos nucleicos de modo a permitir a detecção de sua localização morfológica em células ou cromossomos fixados em lâminas de microscópio. Como o ácido nucleico está imobilizado em estruturas nativas, neste caso, diz-se que a hibridização ocorre in situ.

Hibridização cromossômica in situ

 Um procedimentos simples para mapeamento de genes e outras sequências de DNA é hibridizar uma sonda apropriada de DNA marcado a um cromossomo que foi desnaturado in situ. Para isso, cromossomos metafásicos ou pró-metafásicos, obtidos normalmente a partir de linfócitos de sangue periférico ou de linhagens celulares linfoblastoides, são fixados a lâminas de microscópio. O RNA e as proteínas são removidos da amostra pelo tratamento com RNase e proteinase K, e o DNA cromossômico remanescente é desnaturado por exposição à formamida. O DNA desnaturado é, então, submetido à hibridização in situ por incubação com uma solução contendo uma sonda de ácido nucleico marcado e posteriormente coberta com uma lamínula

 Dependendo da técnica utilizada, o bandeamento cromossômico da amostra pode ser realizado antes ou depois do passo de hibridização. Assim, o sinal obtido após a remoção do excesso de sonda poderá ser correlacionado com o padrão de bandas do cromossomo, permitindo mapear a localização das sequências de DNA identificadas pela sonda. A metodologia de hibridização cromossômica in situ foi revolucionada pelo uso de sondas marcadas com fluorescência, em ensaios de hibridização in situ com fluorescência (fluorescence in situ hybridization, FISH).

Hibridização de tecidos in situ.

 Sondas marcadas também podem ser utilizadas na hibridização de RNA em amostras de tecido. Fatias muito finas de tecido são obtidas com um criostato, a partir de amostras fixadas em blocos de parafina ou congeladas e então aplicadas em lâminas de vidro. Uma solução de hibridização contendo a sonda é aplicada à amostra na lâmina e coberta com uma lamínula. Sondas preparadas a partir de moléculas de RNA complementar de fita simples

(cRNA) são preferencialmente utilizadas nesta abordagem. Como devem ser complementares ao mRNA de um gene, ribossondas antissenso são obtidas a partir da clonagem do gene na orientação inversa, em um vetor apropriado, tal como o pSP64. Nestes casos, a polimerase do fago irá sintetizar transcritos marcados a partir da fita de DNA oposta à fita que é normalmente transcrita in vivo.

 As ribossondas podem ser marcadas com um radioisótopo, tais como "P ou "S, e as 32 sondas hibridizadas são detectadas por autorradiografia. A localização dos grãos de prata é geralmente detectada por microscopia de campo escuro. Neste procedimento, a luz direta não atinge a objetiva; os raios de luz são direcionados lateralmente, de modo que apenas a luz dispersada atinja as lentes do microscópio e o sinal apareça como um objeto ilumina- do contra um fundo preto. Entretanto, uma melhor detecção do sinal pode ser obtida com a utilização da microscopia de campo claro, na qual a imagem é obtida pela transmissão direta de luz através da amostra. Uma alternativa consiste na marcação de sondas com fluorescência e, neste caso, a detecção é feita por microscopia de fluorescência.

Referências

Gonçalves, Macks Wendhell. O Sequenciamento Genômico. In: PUC Goiás. Disponível em: https://professor.pucgoias.edu.br/SiteDocente/admin/arquivosUpload/18497/material/05.%20M%C3%A9todos%20de%20Sequ%C3%AAnciamento%20do%20DNA.pdf. Acesso em: 21 nov. 2023.

Tipos de Sequenciamento: Clássico ao NGS. In: Varsomics. Disponível em: https://blog.varsomics.com/tipos-de-sequenciamento/. Acesso em: 21 nov. 2023.

Fietto, Juliana Lopes Rangel; Maciel, Talles Eduardo Ferreira. Sequenciando genomas. In: Leandro Marcio Moreira. (Org.). Ciências genômicas: fundamentos e aplicações. 1ed. Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética. 2015. Disponível em: https://professor.pucgoias.edu.br/SiteDocente/admin/arquivosUpload/18497/material/Sequ%C3%AAnciamdo%20genomas.pdf.Acesso em: 21 nov. 2023.

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