Clonagem molecular ou tecnologia do DNA recombinante

  Olá pessoal, hoje eu trago novamente um tema de microbiologia já comentado em outro post do blog, mas dessa vez com mais detalhes: a clonagem molecular:

Uma típica clonagem em plasmídeo envolve 5 passos:

1. Digestão da amostra de DNA com enzima de restrição;
2. Digestão do plasmídeo (com gene LacZ e gene de resistência a antibiótico) que será utilizado como vetor com enzima de restrição;
3. Ligação dos produtos da amostra de DNA e do vetor plasmídeo através de DNA-ligases;
4. Transformação da bactéria hospedeira (Escherichia coli) com os produtos da ligação;
5. Crescimento da bactéria transformada nas placas de ágar com a seleção para a resistência ao antibiótico: bactérias não transformadas não os plasmídeos, consequentemente não terão o gene de resistência e morrerão, não formando colônias;
6. Posterior seleção com base na cor das colônias: as bactérias que têm plasmídeos sem o gene de interesse inserido corretamente terão o gene LacZ ativo, que codifica a enzima β-galactosidase, que por sua vez cliva a X-Gal (análogo de lactose) do meio em galactose e um composto azul escuro (tornando a colônia azul). Assim, apenas as colônias brancas são úteis, já que nela há bactérias transformadas com os plasmídeos com o gene de interesse inserido de forma correta, ou seja, interrompendo a atividade do gene LacZ (confirmar com eletroforese).

 Explicando com mais detalhes...

O que é a clonagem?

 Clonar significa fazer uma cópia geneticamente exata, seja de um organismo completo ou até mesmo de um pequeno fragmento de DNA. É aqui que entra a clonagem molecular usada amplamente na ciência, medicina, agricultura e indústria. Uma clonagem molecular envolve a perpetuação de uma MOLÉCULA DE DNA de sequência específica. 

 A clonagem permite o isolamento do gene de interesse (ou outro segmento de DNA) a partir de seu local de origem e sua transferência para um elemento genético pequeno e simples, como um plasmídeo ou um vírus, que é denominado vetor.

 No final da clonagem, o produto que resultará é um DNA recombinante.

Por que utilizar plasmídeos?

 O vetor de clonagem mais utilizado são plasmídeos de Escherichia coli. Eles são moléculas de DNA circular compostas por regiões funcionais:

• Uma origem de replicação;

• Um gene de resistência a determinado antibiótico;

• Um gene LacZ (cor azul);

• Alguns sítios de restrição (região onde o inserto será inserido).

•  O seu limite de clonagem é de 0.1 a 10 kb.

Outros tipos de vetores:

• Cosmídeos: são moléculas de DNA circulares extracromossomais que combinam as vantagens de um plasmídeo com a de um bacteriófago. O limite de clonagem é de 35 a 50 kb;

• Fago lambda: o bacteriófago l infecta células bacterianas e pode ser usado como vector de clonagem. O DNA linear do fago integra o DNA alvo, formando então uma molécula de DNA circular que pode ser injetada em células hospedeiras onde se replica autonomamente, resultando muitas partículas fágicas viáveis. Essas, podem ser utilizadas na infecção de células hospedeiras adequadas, sendo a infecção muito mais eficiente do que a transformação. O limite de clonagem é de 8 a 20 kb.

Como obter o gene de interesse?

 Para a obtenção de um gene de forma isolada, são utilizadas enzimas de restrição. Essas enzimas, são naturalmente sintetizadas em bactérias. Elas atuam reconhecendo pequenas sequências-alvo e cortando a dupla-hélice do DNA em locais específicos, de acordo com a sequência de nucleotídeos do local.

Como inserir o gene no plasmídeo?

 Assim como o gene, o plasmídeo precisa ser cortado com enzimas de restrição para poder ter o gene inserido. Após inserido a DNA-ligase faz a junção das extremidades dos genes com as extremidades do plasmídeo, formando o DNA recombinante.

Como o plasmídeo é inserido na célula bacteriana? Transformação bacteriana

 Após formar o DNA recombinante, ele precisa ser inserido na célula bacteriana para ocorrer a replicação. 

 Esse processo pode ocorrer por 2 métodos: choque térmico e eletroporação.

• Choque térmico: com choque térmico na temperatura de 37° a 42°C, criam-se poros na membrana deixando-a mais fluida e assim o acesso do DNA ao interior da célula é facilitado; 

• Eletroporação: as células são misturadas ao DNA e, em seguida, submetidas a pulsos elétricos curtos de alta voltagem. Esse procedimento torna o envoltório celular permeável, permitindo a entrada do DNA.

Crescimento das bactérias transformadas:

 Espalhar as bactérias transformadas na placa de Petri, contendo meio de cultura ágar + antibiótico para o gene de resistência do plasmídeo.

 Após a transformação, as bactérias são semeadas em ágar contendo o antibiótico correspondente ao gene de resistência presente no plasmídeo.

 Somente as bactérias que possuem o plasmídeo (contendo o gene de resistência) dentro delas conseguirão crescer no meio. Ou seja, bactérias não transformadas (sem plasmídeos) não crescerão.

Como verificar se a transformação ocorreu? meio com X-Gal

 Nesse meio de cultura também é adicionado um substrato cromógeno, como por exemplo a X-Gal.

 A X-Gal é um análogo da lactose, composto por uma galactose e um indol. 

 O plasmídeo possui o gene LacZ, ele codifica a enzima β-galactosidase, que cliva a X-Gal em galactose e um composto azul escuro.

 Para facilitar a visualização e saber se a ligação (plasmídeo + inserto) deu certo ou não, usamos essa mudança de cor nas colônias para fazer a triagem.

 Dois tipos de colônias podem se formar:

• Colônias brancas: bactérias em que os plasmídeos contendo o inserto estão presentes. Isso significa que o gene LacZ foi interrompido pelo inserto, não produziu a enzima e não clivou a X-gal. DEU CERTO!!!

• Colônias azuis: bactérias que têm os plasmídeos, mas eles não tem o inserto. Isso significa que o gene LacZ não foi interrompido pelo inserto e foi transcrito na enzima e produziu a cor azul.

Então, numa placa, após a incubação, você verá esses dois tipos de colônias.

 O objetivo é escolher as colônias brancas, pois são as que contêm a sequência de DNA de interesse (provavelmente).

Como confirmar se o inserto realmente está no plasmídeo?

• Eletroforese em gel de agarose: o próximo passo é selecionar algumas colônias brancas e semeá-las novamente, porém em meio líquido (caldo) e não em ágar.

 Digamos que você selecionou seis colônias. Identifique seis tubos e, em cada um, inocule uma das colônias.

 Após a incubação, você irá realizar a extração somente do DNA plasmidial, com protocolos específicos para esse tipo de extração.

 Para confirmar se naquelas bactérias há mesmo o plasmídeo recombinante (inserto + plasmídeo), é necessário realizar uma reação com a enzima de restrição específica para separar seu inserto do plasmídeo.

 Depois você faz uma eletroforese em gel de agarose e observa se o inserto está presente.

 Se tiver dado certo, você verá duas bandas: uma do plasmídeo e outra do seu inserto.

 Na imagem acima, mesmo que todas fossem brancas, somente as colônias 1, 3 e 4 possuíam o plasmídeo recombinante com seu inserto.

 Às vezes será necessário testar várias colônias brancas para achar uma que deu certo.

 Mesmo ela sendo branca, não significa 100% de certeza que terá seu inserto ligado nos plasmídeos.

O que fazer após a confirmação?

 Com o DNA plasmidial extraído, e a certeza de que seu inserto está ligado a ele, você terá que purificá-lo. Após isso, poderá usar em suas reações subsequentes, como uma PCR quantitativa.

Passo a passo da clonagem molecular na prática:

Referências

CÂMARA, Brunno.O que é e como fazer Clonagem Molecular. Biomedicina Padrão, 2020. Disponível em: https://www.biomedicinapadrao.com.br/2020/02/o-que-e-e-como-fazer-clonagem-molecular.html?m=1. Acesso em: 14 abr. 2024.

MADIGAN, Michael T.; MARTINKO, John M.; BENDER, Kelly S.; et al. Microbiologia de Brock. Grupo A, 2016. E-book. ISBN 9788582712986. Disponível em: https://app.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788582712986/. Acesso em: 13 abr. 2024.