Tecnologia do DNA recombinante

  Olá pessoal, hoje eu trago outro tópico importante de biologia molecular: a tecnologia do DNA recombinante.

Tecnologia do DNA recombinante

 Uma típica clonagem em plasmídio envolve 5 passos:

1. Digestão da amostra de DNA com enzima de restrição;
2. Digestão do plasmídio que será utilizado como vetor com enzima de restrição;
3. Ligação dos produtos da amostra de DNA e do vetor plasmídio através de DNA ligases;
4. Transformação da bactéria hospedeira (Escherichia coli) com os produtos da ligação;
5. Crescimento da bactéria transformada nas placas de ágar com a seleção para a resistência ao antibiótico.

 Explicando com mais detalhes...

 Clonar significa fazer uma cópia geneticamente exata, seja de um organismo completo ou até mesmo de um pequeno fragmento de DNA. É aqui que entra a clonagem molecular usada amplamente na ciência, medicina, agricultura e indústria. Uma clonagem molecular envolve a perpetuação de uma MOLÉCULA DE DNA de sequência específica. 

 A clonagem molecular ou DNA recombinante é um método que permite fazer várias cópias idênticas (clones) de um pedaço específico de DNA. DNA recombinante é a denominação dada às moléculas de DNA que possuem parte de DNA derivados de duas ou mais fontes, normalmente essas fontes são espécies diferentes. Trata-se de processos de transferência de DNA de um organismo para outro.

O fragmento de DNA de interesse deve ser isolado. Isso é possível através de enzimas de restrição, que reconhecem a sequência alvo específica e cortam seletivamente o fragmento que será utilizado.

 Enzimas de restrição: endonucleases originalmente isoladas de microrganismos que usam tesouras moleculares para se defender da invasão de DNA exógeno, principalmente através de vírus. Reconhecem sequências nucleotídicas específicas e cortam o DNA, o local onde a molécula de DNA é clivada pela enzima recebe o nome de sítio de restrição.

Em seguida, o fragmento de DNA é inserido em um vetor, que é uma molécula de DNA na qual um gene é inserido para construir a molécula de DNA recombinante.  Esse vetor geralmente trata-se de plasmídios bacterianos, eles são projetados para permitir a inserção de um DNA exógeno, têm origens de replicação e são capazes de se replicar independentemente do cromossomo bacteriano. 

 Então, o plasmídio é rompido também com enzimas de restrição para permitir a inserção do fragmento de DNA exógeno. O fragmento do gene alvo se une ao vetor, através da enzima DNA ligase, formando o plasmídeo recombinante contendo o gene de interesse.

 A molécula de DNA recombinante produzida é introduzida em um organismo hospedeiro, podendo então ser replicadas. Esse processo é conhecido como transformação, no qual as células bacterianas captam o DNA do ambiente externo.

 As células hospedeiras copiam o DNA do vetor juntamente com o próprio DNA, criando múltiplas cópias do DNA inserido. Alguns exemplos de células hospedeiras são as bactérias Escherichia coli e Bacillus subtilis e a levedura Saccharomyces cerevisiae.

 Por fim, para selecionar apenas as células de interesse o vetor possui um marcador selecionável que permite a identificação de moléculas recombinantes. Um marcador de antibiótico é frequentemente usado, assim uma célula hospedeira sem o vetor morre quando exposta a um determinado antibiótico, enquanto o hospedeiro com o vetor sobrevive e se multiplica, porque é resistente.

 Após as células com o plasmídeo recombinante serem identificadas, elas podem crescer em grande escala, replicando o fragmento de DNA. Nesse momento, damos às bactérias um sinal químico que as instrui a produzir a proteína alvo.

 As bactérias servem como “mini fábricas”, produzindo grandes quantidades de proteína. Por exemplo, se nosso plasmídeo continha o gene da insulina humana, as bactérias começariam a transcrição do gene e a tradução do RNAm para produzir muitas moléculas da proteína insulina.

 A proteína de interesse é então purificada, separada dos demais conteúdos das células, por exemplo, outras proteínas e macromoléculas. Isso garante que não haja nenhuma impureza, restando apenas o produto final, como no caso da insulina.

Referências

BORGES, J. C. Tecnologia do DNA Recombinante. In: IQSC - USP. Disponível em: <https://graduacao.iqsc.usp.br/files/Aula07BioqII-Qui_TecDNARecomb.pdf>. Acesso em: 26 set. 2023.

MACIEL, J (2022). DNA Recombinante. In: QueroBolsa. Disponível em: <https://querobolsa.com.br/enem/biologia/dna-recombinante>. Acesso em: 26 set. 2023.

Os princípios da clonagem molecular: DNA recombinante. In: Kasvi. Disponível em: <https://kasvi.com.br/clonagem-molecular-dna-recombinante/>. Acesso em: 26 set. 2023.